2 通过Lgals3和CD36基因分离出ARC细胞亚群及验证其成脂分化功能降低

为了从SVF中分离和鉴定ARC，研究人员鉴定了两种ARC中高表达的细胞表面蛋白Lgals3和CD36作为分子标记基因（Fig 2B）。研究人员首先利用CD45、CD31和Ter119将iWAT的SVF分为Lin+和Lin-亚群。在Lin-细胞中，研究人员定义Lgals3+ CD36+细胞为ARCs。[小编注：与作者之前发现ARC的策略不同，作者从所有的SVF中发现了ARC，并进一步证明不是免疫细胞（CD45+CD31+），所以后面作者的策略是去掉免疫细胞（CD45+CD31+），再进一步利用表面marker进行流式分选鉴定出ARC]。流式细胞分析表明Lgals3+ CD36+细胞大约占Lin-亚群的33%，这与scRNA-seq数据而估算的细胞比例类似（Fig 2C）。

为了探究SAT在衰老中相关的变化，研究人员使用Fabp4对Lin-亚群的脂肪细胞进行分类。与预期结果一致，48周龄小鼠的SAT中早期脂肪细胞的百分比（3%）显著低于10周龄小鼠（10%）。72周龄小鼠的脂肪细胞百分比进一步下降（0.8%）（Fig2A）。作者也比较了年轻（20周龄）和老年（72周龄）小鼠的SAT重量。结果显示，老年小鼠的SAT质量下降了约50%，而VAT质量和总体重随着衰老而增加（Fig S2A）。这些结果说明衰老过程中，新形成的皮下脂肪细胞减少导致小鼠衰老过程中SAT减少。

接下来，研究人员为了探究ARC的特性，通过qRT-PCR检测了FACS分离的ARC的基因表达。结果显示Lgal3和CD36的水平比Lin-细胞高出约5倍，同时ARC也高表达脂肪祖细胞 (adipose progenitor)标记物，如CD34、Pdgfrα和Pref-1。与Lin+亚群相比，ARC不表达泛免疫标记物CD45或内皮细胞标记物CD31（Fig 2D）。作者进一步检测发现，免疫相关基因，如Jchain、Ptafr、Adgre1（F4/80）的表达水平分别提高了5倍、60倍和40倍；而成脂分化标志基因，如Loxl2和C/ebpβ的表达下降。

之前的研究表明TGF-β1可以抑制APCs和前脂肪细胞（preadipocytes）的分化，而ARCs中TGF-β1的表达量增加了5倍，同时趋化因子的表达量显著增加，如Ccl5、Ccl6和Ccl9，分别增加了6倍、35倍和40倍（Fig 2E）。ARCs高表达调节淋巴细胞分化的转录因子，如Bax、Mafb、和Pu.1，也分别增加4倍，6倍和80倍（Fig 2F）。

为了验证ARC是否是一个不同的细胞亚群，研究人员将FACS分选后的ARC与APC和CD142-High-APC进行了比较。通过qRT-PCR，研究人员发现在ARC中，ARC特异性高表达Pu.1、Ccl6和TGF-β，这些基因的表达水平显著高于APC或CD142-High-APC（Fig S2E）。整体基因表达谱结果说明ARCs表现促炎特征，并且抑制成脂基因的表达。

下一步，研究人员检测了ARCs细胞亚群的体外分化能力。FACS分选以后，他们进行ARCs培养，发现细胞并不能贴壁生长。进一步qRT-PCR分析显示，与CD38分选后的前脂肪细胞（preadipocytes）相比，细胞粘附因子，如Col5a2、Col14a1、Col1a1、Col1a2和Col3a1的表达量显著降低，而转录因子Fli1（可以抑制成纤维细胞胶原合成）的表达升高大约3倍（Fig 2G）。