接下来研究人员在胶原涂层板上培养ARCs来使其贴壁，对ARC和前脂肪细胞（preadipocytes）进行脂肪细胞分化实验。在分化的第0天，基因分析显示ARCs的C/ebpδ、Pparγ和Fabp4表达水平显著降低，而Pref-1表达水平显著升高，上述结果表明ARC可能具有较低的分化能力。油红染色显示，与前脂肪细胞（preadipocytes）相比，ARCs中脂质积累更低。qRT-PCR结果显示Sox9（Sox9是一种已知的抑制脂肪细胞分化的转录因子）的表达增加了2.5倍。并且C/ebpδ、Pparγ和Fabp4等成脂分化因子基因的表达降低2倍（Fig 2H），上述结果表明ARC分化成脂肪细胞的能力受损。当ARCs在较低密度下培养时，它们的增殖能力比前脂肪细胞（preadipocytes）高2倍（Fig 2I）。总结而言，研究人员发现ARCs表达脂肪祖细胞（adipose progenitors）标记物，但它们抑制成脂分化。

接着，研究人员从年轻、老年和高脂喂养的年轻小鼠的SVF中分离ARC并进行比较。FACS分析显示，虽然在年轻小鼠SVF中几乎检测不到ARC，但在老年小鼠中的比例明显提高（Fig 2J，左）。此外，年轻小鼠高脂喂养并不会诱导出现ARC亚群（Fig S2C）。用ARC标记物Lgals3和CD36对iWAT进行组织染色，染色结果显示老年小鼠iWAT中存在ARC，而年轻小鼠iWAT中不存在ARC（Fig S2D）。

为了进一步研究小鼠衰老过程中检测到的ARC亚群是否也存在于人类中，作者将不同年龄健康的捐赠人群的SAT分离出SVF，随后进行流式分选。结果显示在老年人的SAT样本中检测到ARCs（Fig 2J，右）。与小鼠结果相似，研究人员发现随着年龄的增长ARC数量也在逐渐增加，与年轻个体相比，中老年人群中的ARC数量更多。qRT-PCR显示人ARC中LGALS3、CD36和PU.1水平显著高于APCs，并在老年人中表达升高（Fig 2K）。上述结果都表明ARCs确实存在于衰老小鼠和人类的SAT中，并且ARC的存在与年龄相关。

Fig 2 | 通过Lgal3和CD36 分选的成脂能力受损的ARC亚群

Fig S2 | 衰老过程中皮下脂肪组织中出现的以Lgal3和CD36为标记的ARC亚群

3 ARC分泌趋化因子来抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）的增殖和分化

由于ARC具有高免疫特性并分泌多种细胞因子，因此它可能潜在地影响邻近的前脂肪细胞（adipose precursors）。于是研究人员通过共培养实验，检测了ARC对脂肪细胞分化的影响。首先从衰老小鼠iWAT中分离出ARCs，对其进行辐照处理以抑制分化，将这些细胞与3T3-L1细胞共培养，然后进行3T3-L1脂肪细胞分化。油红染色和明场成像（brightfield imaging）显示，对照3T3-L1细胞已完全分化为脂肪细胞。相反，与辐照的ARCs共培养的3T3-L1细胞表现出极少的脂质堆积。qRT-PCR结果显示，与ARC共培养的3T3-L1细胞中Sox9 mRNA水平提高了2倍，而分化成脂标志基因C/ebpβ、C/ebpδ、Pparγ和Fabp4的表达降低了约50%（Fig S3A）。研究人员通过使用来源于ARCs或APCs的生长培养基中检验了ARCs对3T3-L1细胞的脂肪分化的影响。与来自APCs的生长培养基相比，在ARCs生长培养基处理分化的3T3-L1细胞具有更少的脂质积累（Fig 3A）。同时qRT-PCR结果显示：在ARCs生长培养基处理的3T3-L1细胞中C/ebpβ、C/ebpδ、Pparγ和Fabp4的表达水平降低。