Fig 3 | ARC分泌细胞因子抑制邻近前脂肪细胞（adipose precursors）的增殖和分化

Fig S3 | ARC缺乏成脂能力并抑制邻近祖细胞的增殖

4 Pu.1在ARC形成和功能中的作用

研究人员在ARCs的基因表达谱中（Fig 2D）发现， Pu.1在ARCs中的表达量是前脂肪细胞（preadipocytes）的90倍，表达量是所有转录因子中最高的。之前的研究表明Pu.1可以将成纤维细胞转化为巨噬样细胞。研究人员推测Pu.1可能参与衰老过程中ARC的形成。为了验证这一假设，研究人员在3T3-L1细胞中过表达GFP标记的Pu.1，用FACS分离GFP+细胞。qRT-PCR和免疫印迹结果表明Pu.1显著过表达（Fig 4A）。当Pu.1过表达时，ARC标记物Lgals3的表达增加约3.5倍，这表明3T3-L1细胞表型向ARC样细胞转换。

此外，在Pu.1过表达的3T3-L1细胞中，巨噬细胞标志物基因，如Rhoa和Sp3的表达量也显著增加，免疫细胞分化过程的相关转录因子（如Bax和NF-kB1）和趋化因子（如Ccl6）水平升高，Fli1表达也显著增加。同时，过表达Pu.1后，Col1a1和Col3a1表达水平显著降低（Fig 4B）。研究人员对过表达Pu.1的3T3-L1前脂肪细胞（preadipocytes）进行常规RNA转录组测序（Fig 4C）。结果显示大多数富集的基因是免疫细胞调节基因：如白细胞分化、趋化因子产生、白细胞聚集和炎症反应等基因。过表达Pu.1显著增加趋化因子Ccl12和Ccl6表达。相比之下，降低的基因主要是与脂肪形成有关的基因如C/ebpβ和C/ebpδ；以及粘附分子：包括Col1a2、Col3a1和Col5a2。综上所述，过表达Pu.1后的3T3-L1细胞的基因表达变化显示出ARCs细胞亚群的特征（Fig 4D），表明Pu.1是ARCs发育的关键转录因子。

上述结果表明ARCs对脂肪细胞分化有抑制作用（Fig 2F）。接下来，研究人员检测过表达Pu.1的3T3-L1细胞是否能够分化成脂肪细胞。结果显示：与对照3T3-L1细胞不同，过表达Pu.1的细胞不贴壁生长，这反映了它们粘附蛋白的表达降低。油红染色结果显示：过表达Pu.1的细胞分化后的脂质积累降低，Pref-1的mRNA水平是正常细胞的4倍，而C/ebpδ、Pparγ和Fabp4等成脂基因的表达低于对照正常细胞，这些结果提示过表达Pu.1的脂肪细胞分化受损（Fig 4E）。综上所述，Pu.1是ARC功能表型的关键驱动因子。